В.Г. Овсянников, В.В. Алексеев, Н.С. Алексеева, В.С. Отливщикова, Н.Н. Журавлева
ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава», Ростов-на-Дону
В опытах на крысах исследовано влияние острой соматической боли на систему белой крови в онтогенезе. Оценивались изменения фагоцитарной активности, цитохимических показателей и уровня интерлейкинов в динамике у двух возрастных групп при остром болевом раздражении. Выявлено, что у новорожденных животных реакция интенсивна и быстро истощаема, а у месячных крыс реакция лейкоцитов на боль более координирована.
Ключевые слова: острая соматическая боль, лейкоциты, фагоцитоз, цитокины.
Контакты: Виктор Григорьевич Овсянников nataalexeeva@gmail.com
Mechanisms of abnormality of leukocytic phagocytic activity in acute somatic pain in pubertal period V.G. Ovsyannikov, V.V. Alekseev, N.S. Alekseeva, V.S. Otlivshikova, N.N. Juravleva
SEI of HPT «Rostov State Medical University of Roszdrav», Rostov-on-Don
The influence of acute somatic pain on the system of white blood in ontogenesis was investigated in experiments on rats. Changes in phagocytic activity and cytochemical indices and some cytokines were assess in the dynamics of the two age groups during acute pain stimulation. Revealed that the newborn animals the reaction of intense and rapid exhaustion, while the monthly rat leukocyte reaction to pain more coordinated.
Key words: acute somatic pain, leucocytes, phagocytosis, cytokines.
Contact: Ovsyannikov nataalexeeva@gmail.com
В настоящее время накоплено достаточно много информации о морфологическом и биохимическом субстратах боли, ее особенностях при различных заболеваниях и принципах патогенетической терапии [6, 8, 9, 12, 24]. Налицо концентрация интересов исследователей на «ядре» боли, в то время как ее «веерные» механизмы удостоены несравненно меньшего внимания.
В литературе крайне ограниченна информация о роли неспецифической резистентности организма при боли, в том числе и фагоцитоза, как наиболее ранней, срочной и эффективной неспецифической реакции организма [4, 10, 17, 19]. Очевидно, что механизмы фагоцитоза его регуляция мало изучены и приобретают самостоятельное значение в контексте патогенеза боли. Целью настоящего исследования явилось изучение онтогенетических аспектов изменения фагоцитарной активности лейкоцитов при острой соматической боли.
Материал и методы
Исследования выполнены на 180 неполовозрелых нелинейных белых крысах обоего пола без учета половых различий. Все экспериментальные животные были разделены на 2 возрастные группы: новорожденные (3–4 дневные) – 90 крыс, и месячные (90 крыс). Возрастные группы формировались в соответствии с физиологическими критериями периодизации раннего постнатального онтогенеза: 1–7-е сутки – период новорожденности; 30–35 дней – ранний препубертатный период [5]. В работе выполнено 3 серии исследований: 1-я серия посвящена определению фагоцитарной активности. Оценивали изменение фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ); 2-я серия посвящена изучению изменений компонентов цитохимических реакций в лейкоцитах (пероксидаза, щелочная фосфотаза и гликоген) после болевого воздействия; в 3-й серии изучали изменения внутрисистемных гуморальных регуляторов белой крови – интерлейкинов: ИЛ 1α, 4, 6 и фактор некроза опухоли α (ФНО α). Каждая серия включала в себя 2 возрастные группы, а в каждой возрастной группе исследовали исходный фон, изменения через 2 мин и через 60 мин после острого болевого воздействия. Острую соматическую боль (ОСБ) моделировали путем 2-минутного электрокожного раздражения корня хвоста крыс импульсным током (частота импульсов – 100 Гц; амплитуда импульса – 50 В; длительность импульса – 500 мс) с помощью электростимулятора ЭСУ-2. Забор материала для исследования производили на пике развития ноцицептивной реакции (через 2 мин после электростимуляции) и в посттравматическом периоде (через 60 мин после электростимуляции). Для получения биологического материала крыс декапитировали с помощью гильотины и забирали кровь. Все манипуляции с экспериментальными животными проводили в соответствии с Приказом МЗ РФ №267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19 июня 2003 г. Фагоцитарную активность лейкоцитов измеряли in vitro по методу Д.К. Новикова и В.И. Новикова [11]. Для определения пероксидазы в лейкоцитах использовали метод Леле [15]. Щелочную фосфатазу в лейкоцитах оценивали по методу Хейхоу и Кваглино [18, 23]. Для исследования содержания гликогена в лейкоцитах использовали метод ШИК-реакции по Мак-Манусу, основанный на принципе окисления гликолевых групп йодной кислотой, с образованием диальдегидных соединений, которые окрашиваются реактивом Шиффа [13]. Концентрацию интерлейкинов (ИЛ 1α, 4, 6) и ФНО α в сыворотке крови экспериментальных крыс определяли методом иммуноферментного анализа с помощью наборов фирмы Bender MedSystems (Europe) [20–22]. Приготовление растворов стандартов, конъюгатов, промывочного и рабочего буфера проводили согласно инструкции к набору [25].
Достоверность различий по количественным признакам определяли с помощью критерия Стьюдента (t) для малых выборок, признавая их статистически значимыми при p≤0,05. Достоверность различий качественных показателей оценивали с помощью непараметрического критерия статистики (α) ван дер Вардена [1, 14].
Результаты и обсуждение
Результаты исследований фагоцитарной активности представлены в табл. 1 и 2. Через 2 мин после нанесения ОСБ у новорожденных крыс ФИ не отличался от исходного фона, в то же время ФЧ увеличивалось. Через 60 мин после ОСБ показатели, характеризующие фагоцитарную активность, практически не претерпевали изменений. У крыс месячного возраста через 2 мин после ОСБ ФИ и ФЧ снижались по сравнению с исходным состоянием. Через 60 мин ФИ продолжал оставаться сниженным в сравнении с исходным состоянием, однако сами фагоциты постепенно восстанавливали активность: ФЧ приблизилось к исходным значениям (см. табл. 2). Результаты исследования цитохимических характеристик нейтрофилов крыс разных возрастов представлены в табл. 3 и 4. Активность щелочной фосфатазы как у новорожденных, так и у особей препубертатного периода примерно одинакова. Значения цитохимического коэффициента тождественны, а распределение клеток по уровню насыщенности щелочной фосфатазой в одной группе практически повторяет распределение в другой группе животных. Активность пероксидазы выше у крыс препубертатного возраста. В отличие от новорожденных, у крыс месячного возраста клетки с максимальной насыщенностью пероксидазой присутствуют в 16% случаев. Распределение гликогена в лейкоцитах крыс разного возраста не имеет существенных различий, просматривается лишь тенденция превалирования лейкоцитов с высоким содержанием гликогена у новорожденных крыс. Таким образом, распределение щелочной фосфатазы и гликогена в нейтрофилах интактных новорожденных животных и животных препубертатного возраста практически тождественно, активность пероксидазы выше у крыс месячного возраста, что можно расценивать как более высокую готовность к отражению микробной агрессии. С возрастом происходит созревание кислородзависимых механизмов фагоцитоза – системы «респираторного взрыва», одним из компонентов которой является пероксидаза. Так как «респираторный взрыв» базируется на пентозофосфатном окислении глюкозы, становится понятной тенденция возрастного снижения содержания гликогена. Уже через 2 мин после ОСБ у новорожденных крыс наблюдается накопление щелочной фосфатазы в клетках. Обедненные клетки насыщаются ферментом, а потому удельный вес клеток первой (I) группы падает, а третьей (III) – возрастает. Общая направленность процесса сохранялась в динамике эксперимента. Активность пероксидазы лейкоцитов новорожденных крыс практически не менялась в ответ на ОСБ ни сразу, ни через 60 мин. Крысы препубертатного возраста, в отличие от новорожденных, демонстрировали достаточно выраженную цитохимическую реакцию. Общая направленность изменения показателей отражала нарастание активности изучаемого фермента после электростимуляции, что свидетельствует о функциональном созревании кислородзависимых механизмов фагоцитоза. Гликоген нейтрофилов новорожденных крыс лабилен, оперативно включаясь в реакцию на болевое раздражение. Первичная реакция на боль ведет к потере гранул, но уже через час содержание гликогена обретает явную тенденцию к восстановлению. Истощение активности гликогена в большей степени отмечается у новорожденных животных, оно нарастает в динамике эксперимента. Очевидно, активация фагоцитоза у них более энергозатратна. Результаты исследований цитокинов представлены в табл. 5. В сыворотке крови новорожденных крыс после ОСБ уже через 2 мин отмечается увеличение уровня ИЛ 1α, через час этот показатель падает, однако не достигает исходных значений. Уровень ИЛ 1α крыс месячного возраста превышал таковой у новорожденных. Нанесение болевого раздражения, в отличие от новорожденных крыс, не вызывало прироста ИЛ 1α в сыворотке. Через 60 мин после ОСБ уровень ИЛ 1α достоверно увеличивался. У новорожденных крыс через 2 мин после ОСБ происходит увеличение содержания ИЛ 6. Животные препубертатного возраста имели фоновые значения ИЛ 6 в 1,5 раза выше такового у новорожденных. Нанесение болевого раздражения новорожденным животным вызвало реакцию, полярную той, которая отмечалась в отношении ИЛ 1α и ИЛ 6. Наблюдалось уменьшение уровня ФНО α. Через 60 мин содержание ФНО α у новорожденных крыс продолжало снижаться. Иная динамика прослеживалась у животных месячного возраста. В исходном состоянии содержание ФНО α у них было втрое ниже, чем у новорожденных. Нанесение интенсивного болевого раздражения вызвало через 60 мин увеличение содержания ФНО α. После болевой стимуляции динамика изменения ИЛ 4 у животных обеих возрастных групп была идентичной. Содержание ИЛ 4 увеличивалось уже через 2 мин после ОСБ, а к концу 1-го часа стремилось к исходным значениям. В заключение следует подчеркнуть, что динамика цитокинов весьма неоднородна. Особенности реакции зависят как от вида цитокина, так и от возраста исследуемых животных. В целом у животных раннего возраста фагоцитарная система функционально еще не готова к обеспечению полноценной неспецифической резистентности. У животных препубертатного возраста реакция лейкоцитов на боль более координирована. Она менее бурная, прослеживается синхронная активация ферментов, обеспечивающих переваривающую функцию фагоцитов.
Литература
| 1. Боровиков В. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере: Для профессионалов. – СПб., 2003.–688 с. 2. Вальдман А.В., Игнатов Ю.Д. Центральные механизмы боли. – Л., 1976.–191 с. 3. Васильев Ю.Н., Игнатов Ю.Д., Кочан А.Г. и др. Анальгетические эффекты акупунктуры у крыс в свободном поведении и его изменение под влиянием морфина и налоксона//Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1979.– №11.–С.566–569. 4. Вейн А.М., Авруцкий А.М. Боль и обезболивание.–М., 1997.–280 с. 5. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. – Киев, 1983.–383 с. 6. Игнатов Ю.Д. Теоретические и прикладные аспекты боли//Экспериментальные и клинические формы болеутоляющих веществ. – Л., 1986.–С.14–17. 7. Кольма Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия. – М., 2004.–380 с. 8. Крыжановский Г.Н. Патологические интеграции в нервной системе // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2000.–Т.129, №2.–С.124–128. 9. Кукушкин М.Л., Хитров Н.К. Общая патология боли. – М., 2004.–144 с. | 10. Мазурин А.В., Воронцов И.М. Пропедевтика детских болезней.–СПБ., 2000.–408 с. 11. Новиков Д.К., Новикова В.И. Методические рекомендации по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств химических факторов окружающей среды. – М., 1989.–С.21–22. 12. Овсянников В.Г. Очерки патофизиологии боли. – Ростов н/Д, 2003.–159 с. 13. Пирс Э. Гистохимия. – М., 1962.–964 с. 14. Реброва О.Я. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – М., 2003.–312 с. 15. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. – М., 1957.–469 с. 16. Углов Ф.Г., Копылов В.А. Боль как стимулятор защитных и репаративных процессов // Вестн. хир. им. Г.И. Грекова. – 1985.–Т.134, №6.–С.17–22. 17. Филин В.И., Толстой А.Д. Энциклопедия боли. – СПб., 1996.–480 с. 18. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохими/Под ред. Н.С. Кисляк – М., 1983.–319 с. 19. Штрибель Х.В. Терапия хронической боли. – М., 2005.–304 с. 20. Auron P.E., Webb A.C., Rosenwasser L.J. | et al. Nucleotide sequence of human monocyte interleukin 1 precursor cDNA//Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1984.–Vol.81.–P.7907. 21. Cayphas S., van Damme J., Vink A. et al. Identification of an interleukin HPI-like plasmacytoma growth factor produced by L cells in response to viral infection// J. Immunol.–1987. – Vol.139.–P.2965–2969. 22. Dinarello C.A. An update on human interleukin-1: from molecular biology to clinical relevance//J. Clin. Immunol. – 1985.–Vol.5.–P.285. 23. Heyhoe F.G.J., Quaglino A. Cytochemical demonstration and measurement of leucocyte alkaline phosphatase activity in normal and pathological states by a modified azo – dye courling technique//Brit. J. Hemat. – 1958.–Vol.4.–P.375. 24. Jones A.K.P., Kulkarni B., Derbyshire S.W.G. Pain mechanisms and their disorders Imaging in clinical neuroscience //Brit. Med. Bull. – 2003.–Vol.65.–P.83–93. 25. Wood D.D., Bayne E.K., Gowen M.B. et al. The four biochemically distinct species of human interleukin 1 all exhibit similar biologic activities//J. Immunol. – 1985.–Vol.143.–P.895. |