В.Е. Тромза, И.Н. Никифорова
ГУ НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси»
Исследовали антиноцицептивный эффект каннабиноидных лигандов WIN 55,212-2 и AM 1241 на моделях термического болевого воздействия. В тесте отдергивания хвоста WIN 55,212-2 (1,50—3,00 мг/кг) вызывал статистически значимое дозозависимое увеличение латентного периода ответной реакции. Антагонист CB1-рецепторов AM 251 (3,0 мг/кг) полностью блокировал развитие этого эффекта. Аналогичные результаты были получены в тесте горячей пластины. AM 1241 в обоих использованных тестах оказался неэффективным. Таким образом, не выявлено роли CB2-рецепторов в подавлении боли на моделях термического болевого воздействия.
Ключевые слова: каннабиноиды, анальгетические свойства, WIN 55,212-2, AM 1241, мыши. Контакты: Виктор Евгеньевич Тромза vitya_1985@tut.by
Analgesic properties of WIN 55,212-2 and AM 1241 in tail-flick and hot-plate tests V.E. Tromza, I.N. Nikiforova
SI RDC «Institute of pharmacology and biochemistry NAS of Belarus»
The article reviews the analysis of antinoceceptive effect of cannabioid ligands WIN 55,212-2 and AM 1241 on thermal pain models . WIN 55,212-2 (1,50—3,00 mg/kg) leads to statistically significant dose-dependent increase of latency period of response in the tail-flick test. Selective CB1-antagonist AM 251 (3.0 mg/kg, i.p.) totally blocked the development of these effect. Similar results were obtained in the hotplate test. AM 1241 was ineffective in both tests. Thus, the role of CB2- receptors in suppression of pain on thermal pain models is not revealed
Key words: cannabinoids, analgesic properties, WIN 55,212-2, AM 1241, mice.
Contact: Tromza vitya_1985@tut.by
За последнее десятилетие опубликовано множество статей, посвященных детальному описанию болеутоляющего профиля каннабиноидов. Однако нежелательные психоактивные эффекты тетрагидроканнабинола и других агонистов CB1-рецепторов, выявленные в клинических испытаниях, остаются главным барьером для использования их в терапии хронического болевого синдрома. В связи с этим все больше внимания уделяется агонистам CB2-рецепторов, которые в основном локализованы на клетках иммунной системы. WIN 55,212-2 является синтетическим каннабиноидным агонистом, который обладает высоким сродством к обоим типам каннабиноидных рецепторов [11]. Он подавляет развитие болевого поведения на различных моделях острой и невропатической боли [13]. Показана антиноцицептивная активность WIN 55,212-2 в хронических экспериментах на модели боли центрального генеза [2]. Однако, как и любой агонист CB1-рецепторов, он вызывает центральные побочные эффекты, проявляющиеся нарушением двигательной активности, гипотермией. Селективный агонист CB2-рецепторов AM 1241 не вызывает центральных побочных эффектов [10]. Большинство исследователей сходятся во мнении, что активность АМ 1241 проявляется в основном на моделях невропатической боли [3, 8], в то время как опубликованные данные об антиноцицептивной активности этого каннабиноида на моделях острой боли весьма противоречивы [6]. Задачей настоящего исследования явилось изучение эффективности аналгезии у мышей при применении неселективного агониста каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 и селективного агониста CB2-рецепторов AM 1241.
Материал и методы исследования
Эксперименты проведены на мышах линии CBA массой 19—24 г в соответствии с этическими предписаниями исследований экспериментальной боли у животных [14]. Всего было использовано 256 мышей. Животные содержались в условиях вивария с системой автоматической 12-часовой смены освещения и неограниченным доступом к воде и корму. Каждое животное использовалось только один раз и получало только одну дозу испытуемого образца перед тестированием. WIN 55,212-2 и AM 251 (оба — Sigma-Aldrich) растворяли в системе диметилсульфоксид — ТВИН-80 — изотонический раствор натрия хлорида (1:1:18) и вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл/10 г массы тела. AM 1241 (Sigma-Aldrich) растворяли в системе диметилсульфоксид — ТВИН-80 — изотонический раствор натрия хлорида (2:1:17) и вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл/10 г массы тела. Животные контрольных групп получали соответствующий растворитель. WIN 55,212-2 вводили в дозах 1,25—3,00 и 2,00— 5,00 мг/кг в тесте отдергивания хвоста и тесте горячей пластинки соответственно; AM 1241 — в дозах 5,0—10,0 и 5,0—15,0 мг/кг соответственно. Антагонист СВ1-рецепторов AM 251 вводили внутрибрюшинно в дозе 3,0 мг/кг за 45 мин до введения WIN 55,212-2. В этой серии опытов все животные были разделены на 4 группы в зависимости от комбинации вводимых соединений: контроль+контроль, контроль+WIN 55,212-2, AM 251+контроль, AM 251+WIN 55,212-2. Латентный период болевой реакции животных регистрировали до введения субстанции и через 15; 30; 45; 60; 90 и 120 мин после введения (в экспериментах с AM 251 — через 15; 45 и 90 мин после введения второго раствора).
В тесте отдергивания хвоста на хвост животного, помещенного в специальный пластиковый пенал, воздействовали сфокусированным тепловым пучком от лампы автоматизированного аналгезиметра (Tail—Flick Analgesia Meter, Columbus Instruments, США). Регистрировали латентный период отдергивания хвоста от источника боли [5]. Максимальное время болевого воздействия (cut off time) составляло 8,5 с. В тесте горячей пластины мышь помещали на металлическую поверхность прибора (Cold/Hot Plate Analgesia Meter, Columbus Instruments, США), нагретую до 55,0±0,5 °С.
Латентный период рефлекторного ответа (потряхивание и лизание лап либо подпрыгивание) регистрировали остановкой таймера. Величина cut off time равнялось 30 с. В обоих тестах для каждой мыши регистрировали исходную величину латентного периода ответной реакции до введения изучаемых соединений.
Кривые доза—эффект были получены после предварительного выражения анальгетического эффекта в процентах от максимально возможного (МВЭ) с использованием формулы:
где Rt — длительность латентного периода болевой реакции после введения изучаемого соединения; R — исходная величина латентного периода; Сo — максимальное время болевого воздействия. Статистическую обработку результатов проводили с использованием U-критерия Манна—Уитни и критерия Уилкоксона для повторных измерений по алгоритмам пакета Statistica 6.0. Для расчета величины ЕД50 использовали метод прямой оптимизации функции максимального правдоподобия с использованием пробитанализа [1].
Результаты исследования и их обсуждение
В тесте отдергивания хвоста WIN 55,212-2 в дозах 1,50—3,00 мг/кг вызывал статистически значимое дозозависимое увеличение латентного периода ответной реакции по сравнению с показателями контрольной группы животных уже через 15 мин после введения (рис. 1). Порог болевой реакции после введения соединения в дозах свыше 2,25 мг/кг повышался более чем вдвое. Анальгетическое действие соединения сохранялось свыше 2 ч. Величина ЕД50 для WIN 55,212-2 через 15 мин после введения составила 1,65(1,26÷1,90) мг/кг (рис. 2). Антагонист CB1-рецепторов AM 251 (3,0 мг/кг) полностью блокировал развитие анальгетического эффекта WIN 55,212-2 (2,5 мг/кг), однако сам никак не влиял на болевое поведение животных (табл. 1). В тесте горячей пластины выраженный анальгетический эффект WIN 55,212-2 был зарегистрирован через 15— 30 мин после введения. Действие наибольшей из использованных доз сохранялось свыше 2 ч, при этом более 1 ч оно держалось практически на одном уровне (рис. 3).
Как и в предыдущем тесте, в данном случае предварительное введение AM 251 в дозе 3,0 мг/кг полностью предотвращало болеутоляющее действие WIN 55,212-2 (5,0 мг/кг). Сам антагонист не оказывал влияния на болевую чувствительность экспериментальных животных (табл. 2). В обоих использованных тестах селективный агонист CB2-рецепторов AM 1241 оказался неэффективным. В течение 1 ч после его введения статистически значимого изменения длительности латентного периода у животных, получивших разные дозы препарата, по сравнению с животными, получившими растворитель, отмечено не было (рис. 4).
Результаты, полученные при изучении анальгетической активности неселективного агониста каннабиноидных рецепторов синтетического аминоалкилиндольного производного WIN 55,212-2, свидетельствуют о выраженном болеутоляющем действии его на моделях термического болевого воздействия в опытах на мышах и согласуются с данными литературы, касающимися его антиноцицептивной активности на других экспериментальных моделях и с использованием других видов экспериментальных животных [12]. Полное блокирование эффекта WIN 55,212-2, вызванное предварительным введением селективного СВ1-антагониста АМ 251, свидетельствует о реализации анальгетического действия агониста посредством активации СВ1-, но не CB2-рецепторов. Известно, что рефлекторная реакция отдергивания хвоста в ответ на раздражение его терморецепторов является спинальным рефлексом, а в реализации ответной реакции животного на тепловое раздражение кожи лап участвуют также супраспинальные структуры центральной нервной системы. [13].
Эффективность WIN 55,212-2 в обоих использованных тестах подтверждает участие в реализации его антиноцицептивного действия CB1-рецепторов как на спинальном, так и на супраспинальном уровне. В проведенных исследованиях не было выявлено анальгетической активности у селективного агониста СВ2-рецепторов АМ 1241. Полученные нами результаты согласуются с данными B. Bingham и соавт. [4], но расходятся с данными M.M. Ibrahim и соавт., свидетельствующими об обезболивающем действии AM 1241 (0,3—10,0 мг/кг) при системном введении как в тесте отдергивания хвоста при погружении его в горячую воду, так и при воздействии теплового стимула на подошвенную поверхность задней конечности мыши [9]. Считаем перспективным изучение селективных агонистов CB2-рецепторов на моделях невропатической, а не острой боли.
Литература
1. Государственная фармакопея Республики
Беларусь/Центр экспертиз и испытаний
в здравоохранении; Под общ. ред.
Г.В. Годовальникова. — Минск: Минский
государственный ПТК полиграфии,
2006.—С.496—501.
2. Кукушкин М.Л., Игонькина С.И., Чурюканов
М.В. и др. Роль агонистов каннабиноидных
рецепторов в механизмах
подавления центрального болевого синдрома//Бюл.
экспер. биол. и мед. —
2006.—Т.142, № 7.—C.47—50.
3. Beltramo M., Bernardini N., Bertorelli R.
et al. CB2 receptor-mediated antihyperalgesia:
possible direct involvement of neural
mechanisms//Eur. J. Neurosci. — 2006.—
Vol.23.—P.1530—1538.
4. Bingham B., Jones P.G., Uveges A.J. et al.
Species-specific in vitro pharmacological
effects of the cannabinoid receptor 2 (CB2)
selective ligand AM 1241 and its resolved
enantiomer//Br. J. Pharm.—2007.—
Vol.151—P.1061—1070.
5. D’Amour F.E., Smith D.L. A method for
determining loss of pain sensation//J.
Pharm. Exper. Ther. — 1941.—№72—
P.74—79.
6. Guindon J., Hohmann A.G. Cannabinoid
CB2 receptors: a therapeutic target for the
treatment of inflammatory and neuropathic
pain//Brit. J. Pharm. — 2008.—Vol.153.—
P.319—334.
7. Herkenham M., Lynn A.B.,
Johnson M.R. et al. Characterization and
localization of cannabinoid receptors in rat
brain: a quantitative in vitro autoradiographic
study//J. Neurosci. — 1991.—Vol.11.—
P.563—568.
8. Ibrahim M.M., Deng H., Zvonok A. et al.
Activation of CB2 cannabinoid receptors by
AM1241 inhibits experimental neuropathic
pain: pain inhibition by receptors not present
in the CNS//Proc. Nat.l Acad. Sci. USA. —
2003.—Vol.100—P.10529—10533.
9. Ibrahim M.M., Rude M.L., Stagg N.J. et
al. СВ2 cannabinoid receptor mediation
antinociception//Pain. — 2006.—Vol.122—
P.36—42.
10. Malan T.P., Ibrahim M.M., Deng H. et
al. CB2 cannabinoid receptor-mediated
peripheral antinociception//Pain. — 2001.—
Vol.93.—P.239—245.
11. Palmer S.L., Thakur G.A., Makriyannis
A. Cannabinergic ligands//Chem. Phys.
Lipids. — 2002.—Vol.121.—P.3—19.
12. Ulugo A., Ozyigit F., Yesilyurt O. et al.
The Additive Antinociceptive Interaction
Between WIN 55,212—2, a Cannabinoid
Agonist, and Ketorolac//Anesth. Analg. —
2006.—Vol.102.—P.443—447.
13. Walker J.M., Hohmann A.G.
Cannabinoid mechanisms of pain suppression.
— In: Pertwee R. (ed.). Cannabinoids:
Handbook of Experimental Pharmacology. —
Berlin: Springer-Verlag, 2005.—P.509—554.
14. Zimmermann M. Ethical guidelines for
investigations of experimental pain in conscious
animals//Pain. — 1983.—Vol.16.—
P.109—110.